课程名称： 分子生物学实验       英文名称：Experimental Course for Molecular Biology

课程总学时：48                  实验学时：48

课程总学分：1.5

适用专业： 动物医学专业丁颖创新班

一、课程性质与任务

分子生物学实验是生物技术专业一门必修的专业课，涵盖了分子与细胞生物学的许多内容，并与结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、生物医学、分子病毒学、分子免疫学等学科有着重要的联系。分子生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程实验的目的是使学生掌握分子生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。总学时为48学时，其中实验课48学时，第5学期开课。

二、教学目的与要求

本课程的任务是通过实验教学，使学生了解和初步掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法，教学内容包括细菌基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增目的基因及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在实验内容和方法、技术上进行合理安排，力争让学生在有限的课时中尽可能多地了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，并尽可能多地引进、介绍新的、先进的实验方法和技术，以开阔学生视野，提高学生的动手能力和创造性思维能力，培养高素质的生命科学人才。

三、实验项目设置

实验部分                                                     学时

实验一：细菌基因组的提取                                       4   

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：理解细菌破壁的原理，掌握基因组提取的步骤和方法。

3、实验内容

（1） 细菌菌体的收集

（2） 按照试剂盒说明书进行细菌全基因组的抽提

4、实验要求：

（1） 提前预习实验内容，安排具体实验操作步骤。

（2） 注意实验设备的使用事项，保护自身安全。

（3） 掌握移液器和PCR仪的基本操作技术，养成良好的实验操作习惯。

5、实验仪器设备：移液器、离心机、涡旋震荡仪和水浴锅

实验二：特定细菌基因的扩增                                       4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：理论联系实践，掌握聚合酶链式反应的原理和操作。

3、实验内容：

（1）反应体系的制备

（2）PCR仪程序的设置

4、实验要求：

（1）了解PCR反应体系的成分及其作用

（2）掌握PCR仪的使用方法仪器的维护

5、实验仪器设备：移液器、PCR仪和冰箱

实验三：琼脂糖凝胶电泳和DNA片段的纯化                         4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：了解电泳槽的构造，掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

3、实验内容：

（1）琼脂糖凝胶的制备

（2）上样

（3）电泳

4、实验要求

（1）掌握电泳室内的自身安全防护措施

（2）理解电泳槽的结构和原理，掌握电泳槽的使用

（3）掌握凝胶成像仪的操作

5、实验仪器设备：移液器、微波炉、凝胶成像仪和电泳槽

实验四：地高辛标记特定细菌核酸片段                             4 

1、实验类型：研究-创新性实验

2、实验目的 理解地高辛对核酸探针的标记原理和操作方法

3、实验内容：用地高辛对核酸探针进行标记

4、实验要求：掌握地高辛对核酸探针标记的操作方法

5、实验仪器设备：移液枪、离心机和水浴锅

实验五：毛细管转膜法转移核酸片段                               5

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：熟悉毛细管转移核酸的装置，掌握实验操作方法

3、实验内容：将DNA片段从电泳凝胶中转移至膜支持物

4、实验要求：掌握毛细管法转移核酸的操作方法

5、实验仪器设备： 紫外交联仪

实验六：DNA探针杂交核酸片段                                   4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握DNA探针杂交核酸片段的操作步骤

3、实验内容

（1）计算好杂交温度 

（2）用探针对DNA印迹进行杂交

4、实验要求：掌握核酸杂交的方法

5、实验仪器设备：杂交仪

实验七： 杂交结果的显色                                         4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握核酸探针信号检测的步骤

3、实验内容：用化学方法对探针在膜上的位置进行显色

4、实验要求：

（1）理解每种试剂的作用原理

（2）掌握显色的步骤

5、实验仪器设备：水平摇床、

实验八：DNA片段和质粒载体的连接以及鉴定                     4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握DNA片段和质粒载体的连接以及鉴定的操作方法

3、实验内容 

（1）把纯化后的PCR产物（实验三）和质粒载体进行连接

（2）PCR检测DNA片段和载体是否连接成功

4、实验要求

（1）提前对商业化质粒载体进行了解

（2）掌握DNA片段和质粒载体连接的操作方法

（3）注意自身在电泳室的安全

5、实验仪器设备：移液器、恒温仪、PCR仪和电泳槽

实验九：重组质粒的转化                                         4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握质粒转化的操作方法

3、实验内容：重组质粒的转化  

4、实验要求：

（1）严格按照规定时间进行操作

（2）注意无菌操作技术

5、实验仪器设备：无菌操作台、移液器、水浴锅和离心机

实验十：重组体的筛选和鉴定                                    4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：理解蓝白斑显色原理以及掌握重组细菌的筛选和鉴定方法

3、实验内容 

（1）蓝白斑筛选重组体

（2）细菌基因组提取

（3）PCR鉴定重组体是否假阳性

4、实验要求：

（1）注意蓝白斑挑选的操作

（2）掌握重组体筛选和鉴定的流程

（3）注意自身在电泳室的安全

5、实验仪器设备：移液器、超净工作台、离心机、PCR仪和电泳槽

实验十一： 细菌蛋白质的提取                                   4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握蛋白质提取的操作步骤

3、实验内容

（1）细胞的破碎

（2）蛋白的提取

（3）纯化

4、实验要求：

（1）注意高速离心机的操作方法，保护自身安全

（2）掌握超声破碎仪和双直板电泳槽的使用方法

5、实验仪器设备：移液器、高速冷冻离心机、超声波细胞破碎仪、双垂直板电泳槽和水平脱色摇床

实验十二：聚丙烯酰氨凝胶电泳                                   4

1、实验类型：认知-验证性

2、实验目的：掌握聚丙烯酰氨凝胶电泳的操作方法

3、实验内容：

（1）制胶：按照下表制备SDS-PAGE凝胶；

（2）上样：每个加样孔加10 µL样品，蛋白Marker加7µL；

（3）电泳：100 V电压，电泳至高分子量的蛋白Marker充分散开；

（4）染色：电泳完后，去除凝胶上层的浓缩胶，放置于平皿中，加入考马斯亮蓝染色液，40 rpm，室温染色2 h；

（5）脱色：倒去平皿中的染色液，清洗后，加入脱色液，40 rpm，室温脱色过夜。

4、实验要求：

（1）掌握聚丙烯酰氨凝胶的制备

（2）了解双垂直板电泳槽的构造和使用方法

5、实验仪器设备：BIO-RAD双垂直板电泳槽、水平脱色摇床和移液器

四、考核方式与方法

成绩评定    比例（%）

1、实验报告                                         40%

2、实际操作                                         40%

3、结果判定                                        20%    

五、实验指导教材与参考资料

1. 教材：

吴建祥主编，《分子生物学实验》，浙江大学出版社，2014年第一版

2. 参考资料：

（1）F.M.奥斯伯主编，《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，2008年第一版

（2）沃森主编，《分子克隆-实验指南》， 科学出版社，2002年第三版

                                      （撰写人：张荣民  审核人：孙永学）